第八章微生物的遗传变异和育种

　　遗传性：亲代具有把他所有的形状给子代的特性。变异性：子代具有改变亲代遗传性状的特征。遗传型（genotype），表型（phenotype），变异（varition），饰变（modification）。

　　第一节

　　遗传变异的物质基础三个经典实验： 转化试验：1928 年，F. Griffith，肺炎双球菌， Streptococcus pneumoniae。1944 年,O.T.Avery DNA RNA 蛋白质多糖DNA+DNA 酶RⅡ RⅡ RⅡ RⅡ RⅡ 少量SⅢ - - - ___ 噬菌体感染试验:1952 年,A. D. Hershey（侯喜） M. Chase（蔡斯） 病毒的重建试验: 1956 年，H. Fraenkel-Conrat （弗朗克－康勒脱） 噬菌体感染试验和病毒的重建试验的说明图见下页

　　19朊病毒的发现和思考：蛋白质是否是遗传的物质基础？prpsc，蛋白质折叠。DNA 的结构基本单位是核苷酸：核糖(戊糖)＋碱基＋磷酸。碱基有四种：腺嘌呤（A），鸟嘌呤（G），胸腺嘧啶（T）， 胞嘧啶（C）。单链上的碱基不受配对的限制，决定了遗传的多样性。半保留的自我复制保证了生物遗传的相对稳定。

　　第二节

　　基因突变和诱变育种20 基因突变（gene mutation）：突变细胞的遗传物质的分子结构或数量发生可遗传的变化。突变的类型： 营养缺陷型（auxotroph）菌株:野生型菌株发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力,从而不能在基本培养基上生长的变异菌株。抗性突变型 （resistant mutant）菌株:野生型菌株发生基因突变而对某化学药物或致死物理因子产生抗性的菌株。

　　条件致死突变型（conditional lethal mutant）菌株:菌株发生基因突变后,在某种条件下可正常生长，而在另一种条件下无法生长。形态突变型（morphological mutant）菌株:菌株发生基因突变，而在个体形态或菌落形态上发生突变的菌株。抗原突变型（antigenic mutant）菌株:菌株发生基因突变，而在细胞抗原结构上发生变异的菌株。产量突变型（metabolite quantitative mutant）菌株:菌株发生基因突变，在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株。正变株（plus-mutant）；负变株（minus- mutant）。突变率（mutation rate）：一个细胞每一世代某一性状突变的几率；群体中每一世代（分裂一次）产生突变的个数。突变率：10－8 基因突变的特点： 不对应性：突变的性状与引起突变的原因之间没有直接的对应关系； 自发性（10－6～10－9）；稀有性；独立性；可诱变性；稳定性； 可逆性：回复突变（reverse(back)mutation）。证明基因突变自发性和不对应性的实验： 变量试验(fluctuation test)：波动试验、彷徨试验；1943 年；S. E. Luria＆ M. Delbruck。涂布试验：1949 年，H.B.Newcombe 影印平板培养法(replica plating):1952 年,J. Lederberg 微生物产生抗药性的途径： 基因突变而产生抗药性； 抗药性质粒的获得(R 因子)； 生理上的适应。基因突变及其机制： 右图为突变的类型。

　　21诱变（induced mutation）： 碱基的置换（substitution），转换（transition），颠换（transversion）。两个例子:亚硝酸；5-溴尿嘧啶(碱基类似 物base analog)。移码突变(frame-shift mutation phase-shift mutation)

　　22染色体畸变(chromosomal aberration) 转座(transposition)：DNA 序列通过非同源重组的方式，从染色体某一部位转移到同一染色体的另一部位或其它染色体上的某一部位。转座因子(transposable element):具有转座作用插入序列(insertion sequence，IS)；转座子（transposon，Tn）； 转座噬菌体(transposable phage) 自发突变（spontaneous mutation）：由微生物自身有害代谢产物引起；由DNA 复制过程中碱基配对错误引起；由背景辐射和环境因素引起。遗传密码改变的表型效应：

　　23紫外线对DNA 的损伤及其修复紫外线(ultraviolet ray)对DNA 的损伤；嘧啶二聚体； 光复活作用(photo reactivation，photo restoration) 切除修复（excision repair） 突变与育种自发突变与育种（ Breeding by spontaneous mutation） 从生产中育种；定向培育优良菌株。自然选育的目的：维持原有的产物的合成水平(稳产)；诱变后的菌株群体中表现出各种生理特性需要纯化。诱变育种 （breeding by induced mutation） 诱变育种的几个方向：提高产量；改进产品质量；产生新的生物活性物质诱变育种的基本环节（左图所示） 出发菌株→诱变→初筛→复筛→放大→获得优良变异株。诱变育种两个主要的环节：诱变（induced mutation）；筛选（screening）。诱变育种中的几个原则： 诱变剂的选择：简便有效； 诱变剂的种类：物理诱变剂，化学诱变剂，拟辐射物质（radiomemetic chemical）； 诱变剂量的选择：存活率或死亡率曲线，剂量-诱变率曲线； 出发菌株(original strain)的选择：处理细胞所处的状态，一般为单孢子悬液； 表型延迟(phenotype lag)：遗传型虽已突变,但表型却要经染色体复制、分离和细胞的分裂后才表现出来。利用复合处理的协同效应（synergism）；利用和创造形态、生 理和产量之间的相关指标；设计高效的筛选方法：推理选育。突变株的筛选:产量突变株的筛选,抗药性突变株的筛选,营养缺陷型菌株的筛选

　　24营养缺陷型突变株：野生型菌株（wide type strain）；原养型（prototroph）； 回复突变株（back mutant, reverse mutant）；基本培养基（minimum medium,MM)； 补充培养基(supplemented medium，SM）；完全培养基（complete medium，CM）。前体1→A→B→C→D→前体2 途径α β γ 酶↑ ↑ ↑ a b c 基因一个基因一条多肽链筛选营养缺陷型菌株的四个环节： 诱变；淘汰野生型（抗生素法，菌丝过滤法）；检出缺陷型（夹层培养法，限量补充法，逐个检出法，影印平板法）；鉴定缺陷型（生长谱法）。维生素的生长谱营 养缺陷型菌株的应用：赖氨酸，研究代谢途径。氨基酸的生长谱

　　25研究代谢途径： 粗糙链孢霉（Neurospora crassa） 瓜氨酸－ ＋ ＋ 鸟氨酸－ － ＋ 突变株Ⅰ 突变株Ⅱ 突变株Ⅲ 精氨酸＋ ＋ ＋ 前体→鸟氨酸→瓜氨酸→精氨酸→.. 艾姆氏试验(Ames test)：生物的遗传物质是核酸；凡对微生物有效的诱变剂对高等动物同样有效；化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌率成正比；凡致癌物质都是诱变 剂，但并非所有的诱变剂都能致癌；95％的致癌剂有诱变作用， 约90％的非致癌剂就没有诱变剂的作用。材料：鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株，老鼠肝脏抽提液。

　　第三节

　　基因重组和基因杂交基因重组(gene recombination) 遗传重组(genetic recombination)：两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程。原核生物的基因重组转化 (transformation) 转导(transduction) 接合(conjugation, mating) 原生质体融合(protoplast fusion) 转化：受体菌直接吸收来自供体菌的DNA 片段，通过交换把他整合到自己的基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的现象。受体细胞（recipient cell, receptor） 供体细胞（donor cell） 转化子（transformant）

　　26 局限转导感受态：受体细胞最易接受外源DNA 片段并实现转化的生理状态。转化的过程：感受态细胞吸收DNA；DNA 掺入细胞后的整合。转化的要求：受体细胞处于感受状态（competence） 转化的特点：直接吸收；受体细胞处于感受态转染（transfection） 转导：通过缺陷噬菌体的媒介，将供体细胞的DNA 片段携带入受体细胞中，通过交换和整合， 使后者获得前者的部分遗传性状。缺陷噬菌体（defective phage） 转导子（transductant） 普遍性转导（generalized transduction）：完全缺陷噬菌体。特点：随机包裹；转导子非溶原性。局限性转导（specialized transduction）：部分缺陷噬菌体。特点：转导的是特定基因；转导子为缺陷溶原性。普遍性转导和局限性转导的比较普遍性转导和局限性转导的比较 普遍转导任何基因能转导的基因不结合到寄主上噬菌体在寄主中的位置获得转化噬菌体的方式转导子的区别通过敏感菌的裂解非溶原性特定基因结合到寄主上通过溶 源菌的诱导部分溶原性

　　27溶源转变lysogenic conversion 接合：供体菌（F＋菌株，雄性菌株）通过性菌毛与受体菌（F-菌株，雌性菌株）直接接触，把F 质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得若干新的遗传性状。F+菌株；F-菌株；Hfr 菌株；F’菌株。特点：两细胞直接接触；需要性因子性因子可通过接合获得。原生质体融合：通过人工的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合， 从而获得兼有两亲本遗传性状的重组子。原生质体技术的优越性：去掉了细胞壁的障碍，亲株基因组可直接融合、交换，并为链霉菌实现基因转化创造了条件；二亲 株的基因组之间可发生多次交换，得到多种类型的重组子， 且参与融合的亲株不限于一个，可以多至3、4 个；重组频率高；可用诱变的方法直接处理原生质体，提高突变率；再生成细胞壁的过程常伴随治理的消除，使染色体发生改变；极其简单，操作方便，不需要贵重 药品。

　　28如何得到原生质体：菌体（菌丝）培养；细胞壁的去除；原生质体的融合（再生）； 检出重组子。再生频率的计算： 原生质体数H－原生质体数水再生频率＝------------ 原生质体总数（血球计数） 原生质体技术的应用：利用原生质体形成及再生达到改良亲本的目的（大环内酯类抗生素）；利用原生质体诱变提高突变率（庆大霉素）；利用原生质体融合获得性 的抗生素（Indolizomycin）；利用再生，得到了产量提高的变异菌株，例如生二素链霉菌（Streptomytece ambofaciens）通过原生质体再生，螺旋霉素的生产能力提高了三倍多。质粒消除的结果常常导致细胞染色体的改变，或使次级代谢途径发生变化(白霉 素和金丝霉素)，出现有利于提高抗生素产量的变异菌株。有效的种间融合，使两个产生不同抗生素菌株的调节基因和结构基因重组在一起，诱发一些原来为“沉默 基因’的表达，从而产生新物质。同时种间融合还可能使两个产生不同抗生素菌株的结构基因重组而产生杂种抗生素。真核微生物的基因重组有性杂交 （sexual hybridization） 准性杂交（parasexual hybridization） 同种而不同菌株的体细胞间发生的融合，常见于半知菌类。准性杂交过程：菌丝联结（anastomosis）；形成异核体（heterocaryon）；核 融合（nuclear fusion）；体细胞交换（somatic crossing-over）和单倍化。

　　第四节

　　基因工程基因工程(gene engineering) 遗传工程（genetic eng ineering）：人工的离体的分子水平上的遗传重组技术。基本操作：获取目的基因；优良载体的选择； 目的基因与载体DNA 的体外重组；重组载体导入受体细胞（转化）；重组受体细胞的筛选和鉴定；工程菌的表达。

　　29对质粒载体的要求：是一个独立的复制子；具有较多的单一限制性内切酶位点；有方便的筛选标记；具有外源DNA 片段插入失活的附加标记；高拷贝数。应用： 生产多肽类药物:干扰素(interferon)，白细胞介素（ interleukin ）； 生产疫苗：乙肝疫苗； 改造传统工业发酵的菌种； 改良动植物的特性； 用于环境保护的“超级菌”的构建。工程菌的不稳定性。

　　30第五节

　　菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退和复壮衰退（degeneration）:菌种的特性发生了负变，如生长速度减慢、代谢产物合成能力下降。菌 种衰退的原因：自发突变。衰退的防止：控制传代次数；创造良好的培养条件；利用不易衰退的细胞传代； 采用有效的菌种保藏方法。复壮：从已衰退的群体中筛选出少数没有退化的个体。菌种的复壮：纯种分离法(pure culture isolation)，包括菌落纯（pure culture in colony lever）和菌株纯（ pure culture in strain lever ）； 通过寄主体复壮。菌种的保藏菌种保藏的意义：菌种是一个国家极其重要和宝贵的生物资源。菌种保藏的原理：通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干 燥和低温， 使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。菌种保藏的方法： 斜面冰箱保藏法：斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后， 置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4℃冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月沙土管保藏法：适合于产孢子或芽孢的微生物。将斜面孢子制成孢子 悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱内保存。一般保存期为1 年左右。菌丝速冻法：对于不产孢子或芽孢的微生物，一般不能用沙土管保藏。为了方便可以采用甘油菌丝速冻法。由于该法的保藏温度为-20℃，为了避免微生 物受损伤致死，需要甘油作为保护剂。甘油的最终浓度为25%。石蜡油封存法：向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面一厘米，然 后保存在冰箱中。此法可适用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。真空冷冻干燥保藏法：目前常用的较理想的一种方 法。在真空中使水分升华。微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。菌种保存时间一般５年左右。需要一定的设备。保护剂一般采用脱脂牛奶或血清等。保 护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构型，防止细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，使微生物疏松地 固定在上面。液氮超低温保藏法：适用范围最广的微生物保藏法。尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其它保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最长。原理： 用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达-196℃，远远低于其新陈代谢作用停止的温度(－130℃)，所以此时菌种的代谢活动已停止，化学作用亦 随之消失。需要保护剂，常用的保护剂为10%甘油。先将菌液降温到0℃，再以每分钟降低1℃的速度，一直降低到-35℃，然后才把装有菌液的安瓿管放入液 氮罐的气相中。

　　国内菌种保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会(China Committee for Culture Collection of

　　31 Microorganisms． CCCMS)委托中国科学院负责担负全国菌种保藏管理业务，下设六个菌种保藏管理中心。l)普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC) 中国科学院微生物研究所，北京(AS)：真菌，细菌。中国科学院武汉病毒研究所，武汉(AS-IV)：病毒。2)农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC) 中国农业科学院土壤肥料研究所，北京（ISF）。3)工业微生物菌种保藏管理中心(CICC) 轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京(IFFI)。4)医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC) 中国医学科学院皮肤病研究所，南京(ID):真菌。卫生部药品生物制品检定所，北京(NICPBP)：细菌。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。5) 抗生素菌种保藏管理中心(CACC) 中国医学科学院抗生素研究所，北京(IA)。四川抗生素工业研究所，成都(STA)：新抗生素菌种。华北药厂抗生素研究所，石家庄(IANP)：生产用抗 生素菌种。6)兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC) 农业部兽医药品监察所，北京。国外菌种保藏机构l)ATCC American Type Culture Collection． Rockvill． Maryland． U.S.A． 美国标准菌种收藏所，美国，马里兰洲，罗克维尔市。2) CSH Cold Spring Harbor Laboratory. U.S.A． 冷泉港研究室，美国。3) IAM Institute of Applied Microbiology. University of Tokyo， Japan． 日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。4) IFO Institute for Fermentation. Osaka, Japan． 发酵研究所,日本大阪。5) KCC Kaken Chemical Company Ltd. Tokyo， Japan． 科研化学有限公司，日本东京。6) NCTC National Collection of Type Culture. London , United Kingdom． 国立标准菌种收藏所，英国伦敦。7) NIH National Institutes of Health. Bethesda， Maryland， U.S.A． 国立卫生研究所，美国，马里兰洲，贝塞斯达。